Per biocontrollo si intende la capacità di un essere vivente, nel nostro caso un microrganismo, di contrastare lo sviluppo o l’attività di altre forme viventi (in enologia, nuovamente microrganismi) che potrebbero in qualche modo alterare il vino.
L’intuizione circa la presenza in natura di queste forme di interazione competitiva è presente da lungo tempo, e anche in enologia è nota da molti anni l’importanza della scelta attenta dei lieviti e dei batteri lattici selezionati, in modo che questi possano ordinatamente condurre le rispettive fermentazioni, senza intralciarsi reciprocamente.
Articolo tratto dal numero 5/2021 di VVQ
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Risorse nel microbiota
Negli ultimi anni l’avanzamento della conoscenza riguardo alla popolazione microbica ha portato alla formulazione del concetto di “microbiota” ovvero la comunità di microrganismi e le interazioni reciproche che tra di essi si instaurano in un determinato ambiente, siano queste interazioni costruttive, come nel caso della simbiosi, o negative, tese ad eliminare i concorrenti per una determinata “nicchia ecologica”.
Una sorta di “legge della giungla” che può avere interessanti risvolti applicativi in enologia se, come già oggi in alcuni casi succede, la presenza di un microrganismo utile, o anche semplicemente non in grado di interferire con la vinificazione, può contrastare lo sviluppo di microrganismi alterativi senza che si debbano adottare pratiche curative, come la filtrazione, o aggiungere antisettici, come l’anidride solforosa. Il biocontrollo è già ampiamente sperimentato in vigneto, in cantina è possibile indentificare due strategie di biocontrollo che l’enologo può implementare per prevenire le alterazioni microbiologiche:
- competizione di due o più specie microbiche per l’occupazione di un determinato ambiente;
- produzione di molecole tossiche verso microorganismi dannosi.
Vediamo ora nel dettaglio questi due fenomeni.
Le interazioni tra due microrganismi possono essere simbiotiche, dove vi è per entrambi beneficio dalla convivenza, o parassitarie, dove una specie trae vantaggio dall’altra, senza tuttavia danneggiarla
Meccanismi di interazione microbica
Come abbiamo accennato, le modalità con le quali un microrganismo può inibire altre forme microbiche sono due. La prima, certamente più diffusa, è quella che vede lo sviluppo di una determinata specie microbica in un determinato ambiente, a scapito delle altre.
Le interazioni tra lieviti e batteri lattici sono oggetto di studio da diversi anni. Oggi è chiaro che i lieviti possono disturbare l’attività batterica mediante la produzione di diversi metaboliti, anidride solforosa, acidi grassi a media catena. I batteri lattici non sono capaci di produrre molecole tossiche per i lieviti, possono tuttavia entrare in competizione per i substrati nutritivi del mosto.
In ogni ambiente, ad esempio un tino appena riempito di mosto, così come un carro d’uva, le fonti nutrizionali sono limitate e le variabili ambientali (disponibilità di zuccheri, temperatura, pH, presenza di antimicrobici) regolano lo sviluppo microbico. Pertanto, una specie che si trovasse maggiormente a suo agio potrà rapidamente svilupparsi, consumando i substrati e impendendo quindi lo sviluppo di altre specie.
In questa forma di biocontrollo la quantità iniziale di microrganismi e la capacità di adattarsi rapidamente all’ambiente giocano un ruolo fondamentale. In enologia vi sono alcuni esempi già disponibili in tal senso. Ad esempio, alcuni ceppi di lieviti non-Saccharomyces sono proposti per un inoculo diretto sulle uve, prima della macerazione prefermentativa a freddo.
Evidentemente, il loro ruolo non è quello di condurre la fermentazione alcolica, ma di contrastare lo sviluppo di microrganismi alterativi. Brettanomyces bruxellensis è notoriamente presente già sulle uve e capace di accrescere il numero di cellule anche a basse temperature, al contrario di Saccharomyces cerevisiae, lo stesso fenomeno è osservato nel caso di altri microrganismi alterativi come Schizosaccharomyces sp.
Vi è poi una forma di biocontrollo nella quale alcuni microrganismi sono capaci di produrre molecole in grado di interferire con l’attività di altre specie microbiche. Queste molecole sono comunemente descritte come proteine killer o batteriocine e generalmente sono in grado di interferire con la replicazione cellulare dei microrganismi target, limitandone lo sviluppo della popolazione.
Le tossine killer sono note da tempo, in passato sono state una delle principali caratteristiche utilizzate per la selezione di nuovi ceppi di S. cerevisiae. Tuttavia non è facile individuare ceppi di lievito che, senza alterare il vino, siano in grado di produrre molecole selettive, inibendo solo i microrganismi alterativi, ma questa applicazione è certamente molto interessante, come testimoniano i numerosi lavori scientifici sul tema.
Cosa dice la scienza?
Il biocontrollo è certamente un interessante modello di interazione microbica e le potenziali applicazioni pratiche hanno sollecitato la ricerca in quest’ambito. Sui principali motori di ricerca in ambito accademico sono dunque rintracciabili numerosi lavori sul tema, vediamone alcuni.
Occorre distinguere tra crescita della popolazione microbica e attività fermentativa, i due fenomeni non son strettamente correlati e in determinate condizioni, ad esempio a freddo o in presenza di ossigeno, si può osservare una crescita della biomassa senza evidenti fermentazioni.
Già nel 2009 ricercatori spagnoli (Santos et al., Microbiology-sgm, Volume 155 del 2009) avevano individuato un ceppo di Pichia membranifaciens capace di secernere una tossina killer in grado di inibire lo sviluppo di lieviti e muffe.
La tossina killer è stata purificata e caratterizzata dal punto di vista biochimico, osservando che questa molecola mantiene una buona attività anche a pH acidi ed è in grado di inibire Brettanomyces bruxellensis, mentre Saccharomyces cerevisiae è risultato resistente a questo agente tossico. In micro vinificazioni sperimentali sia la tossina che il lievito P. membranifaciens si sono dimostrati in grado di inibire lo sviluppo del Brett. Gli stessi ricercatori nel 2011 hanno identificato altre tossine attive contro Brettanomyces bruxellensis, prodotte dal fungo Ustilago maydis.
L’aspetto interessante di questa nuova ricerca è che le tossine fungine si sono dimostrate efficaci a pH compreso tra 3.00 e 4.00 e a temperature inferiori ai 20°C, dunque in condizioni iniziali per la vinficazione (Santos et al., International Journal of Food Microbiology, Volume 31 del 2011).
Anche in Italia il tema del contrasto al Brettanomyces mediante l’impiego di agenti di biocontrollo è un tema di attualità.
Ad esempio, il gruppo di ricerca dell’Università delle Marche guidato dal prof. Ciani ha pubblicato nel 2014 un lavoro riguardante la capacità di ceppi di Metschnikowia pulcherrima di inibire l’azione di diversi generi di lievito di interesse enologico come Candida, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Saccharomycodes, Torulaspora e Brettanomyces. Nuovamente, S. cerevisiae si è dimostrato piuttosto tollerante alla presenza di tossine prodotte da altri lieviti, mentre i generi Brettanomyces, Hanseniaspora e Pichia si sono dimostrati piuttosto sensibili.
I risultati, confermati da prove di micro vinificazione, suggeriscono la possibilità di utilizzare inoculi multipli di lieviti per gestire la fermentazione alcolica e, nel contempo, inibire i microrganismi alterativi. (Oro et al., Journal of Applied Microbiology, volume 116 del 2014).
Antagonisti contro la muffa grigia
Anche il contrasto alle muffe in grado di svilupparsi nelle ultime fasi della maturazione delle uve ha visto applicazioni nell’abito del biocontrollo. Le infezioni da Botrytis cinerea prima della raccolta o durante l’appassimento sono un concreto problema per i viticoltori in quanto non vi è la possibilità di impiegare agenti chimici di contrasto che non rispetterebbero i tempi di carenza necessari a non lasciare residui nei mosti.
In un articolo pubblicato nel 2015 (Wilson et al. Frontiers in Microbiology, Volume 7 del 2015) si descrive il processo di selezione di ceppi di lieviti con presunta attività antifungina da mosti in fermentazione ottenuti da uve surmature, dove dunque era frequente la presenza di muffa grigia sulle uve.
Lo sviluppo nel medesimo ambiente di muffe e lieviti è un efficace metodo per selezionare ceppi di lievito con attività di biocontrollo verso le muffe, microrganismi particolarmente aggressivi. Infatti, in questa ricerca è stato possibile isolare numerosi ceppi di Starmerella bacillaris, con attività antifungina verso B. cinerea.
Il Vino Santo Trentino è prodotto oggi da 8 cantine della Valle dei Laghi, un distretto vitivinicolo a Ovest di Trento. Grazie a un clima fresco e ventilato per le brezze provenienti dal Lago di Garda le uve di Nosiola sono appassite naturalmente in solai fino alla settimana santa e dopo torchiatura, i mosti subiscono un lento processo di fermentazione e affinamento.
Volendo indagare il meccanismo di biocontrollo sviluppato da questo lievito è stato osservato come la produzione di composti organici volatili è la principale responsabile degli effetti antifungini di S. bacillaris. Tutti i ceppi si sono dimostrati in grado di ridurre lo sviluppo di B. cinerea sugli acini d’uva danneggiati meccanicamente e artificialmente inoculati con muffa grigia. Il lievito è stato capace di colonizzare rapidamente le aree del grappolo danneggiate e non ha interferito nella successiva fermentazione alcolica, condotta con ceppi selezionati di S. cerevisiae, anzi riducendo la resa in alcol e aumentando il tenore di glicerolo, un interessante carattere oggi dove l’eccesso alcolico è un problema piuttosto sentito.
Valorizzare i ceppi autoctoni
Anche in Trentino sono state condotte ricerche per valorizzare ceppi autoctoni di lieviti in attività di biocontrollo (Guzzon et al., European Food Research and Technology, volume 239 del 2014).
L’approccio seguito è il medesimo del precedente lavoro, isolare microrganismi sviluppatisi in coabitazione con B. cinerea e che dunque si sono dimostrati capaci di resistere all’azione di questo fungo. La sorgente di isolamento presa in considerazione sono state le uve di Nosiola in appassimento per la produzione di Vino Santo Trentino, in Valle dei Laghi. La caratterizzazione della microflora presente sulle uve ha rilevato una notevole biodiversità e una sensibile differenza tra uve appassite per semplice disidratazione e uve attaccate dalla “muffa nobile”.
I generici di lievito più frequenti nei campioni di uve sono stati Hanseniaspora, Metschnikowia, Cryptococcus e Issatchenkia, tra i batteri è stata osservata la presenza di microrganismi riconducibili a Bacillus, Microbacterium, Acetobacter e Gluconobacter.
7 ceppi si sono dimostrati capaci di inibire lo sviluppo di B. cinerea in test di antagonismo svolti in laboratorio sia in terreno sintetico che in mosto d’uva. Prove di micro vinificazione hanno dimostrato come questi microrganismi non abbiano alcuna attività alterative nel vino, soccombendo dopo pochi giorni di fermentazione alcolica, a causa dell’accumulo di etanolo.
Il biocontrollo in cantina oggi
Se queste sono le evidenze della ricerca, quali sono oggi le effettive strategie di biocontrollo in cantina? Vediamole seguendo il logico svolgersi del processo di vinificazione.
Vendemmia e fasi pre-fermentative. Prima dell’avvio della fermentazione alcolica è possibile un approccio al controllo della flora microbica indigena, potenzialmente alterativa, alternativo all’impiego di anidride solforosa, basandosi su lieviti non-Saccharomyces da inocularsi direttamente sulle uve o nei mosti immediatamente dopo la pigiatura. Questi microrganismi non hanno una spiccata attività fermentativa, ma possono contrastare direttamente o indirettamente lo sviluppo di altri microrganismi alterativi. Anche un inoculo frazionato di S. cerevisiae, parte sulle uve e parte dopo la macerazione pre-fermentativa, segue la stessa logica.
Fermentazioni enologiche. In queste fasi, in attesa che siano proposti sul mercato ceppi di lievito con azione diretta verso i microrganismi patogeni, è possibile attuare un biocontrollo indiretto, utilizzando ceppi di S. cerevisiae dalla buona vigoria e dal provato carattere killer per una rapida ed efficace prevalenza sulla microflora indigena. Anche la co-fermentazione tra lieviti e batteri può rivelarsi utile riducendo il tempo necessario a completare le fermentazioni enologiche, garantendo la presenza di una microflora utile ed efficiente per entrambi gruppi microbici di maggiore interesse enologico, lieviti e batteri. Infine, l’uso in sequenza di ceppi di lievito appartenenti a differenti generi può contribuire a ridurre l’incidenza di alcuni problemi che sistematicamente affliggono la vinificazione. Ad esempio, utilizzano ceppi di Torulaspora e Saccharomyces è possibile ottimizzare la fermentazione alcolica in mosti particolarmente ricchi di zuccheri, riducendo lo stress osmotico e l’innalzamento dell’acidità volatile. Altri lieviti possono correggere l’acidità fissa del vino, incrementandola e dunque contribuendo a rendere il vino più conservabile.
Fasi post-fermentative. Durante l’affinamento del vino la presenza di microrganismi è sempre un fattore di rischio, dunque un biocontrollo in senso stretto è difficilmente attuabile.
Nondimeno vi sono molecole d’origine fungina, come i chitosani, che rappresentano una valida alternativa ad agenti antimicrobici di origine chimica.
Conclusioni
Il biocontrollo è più uno stile di vinificazione, frutto di una buona consapevolezza degli equilibri che si instaurano tra i microrganismi, che una mera applicazione di specifici prodotti alle uve o ai mosti. È dunque già oggi possibile lavorare prevenendo lo sviluppo delle alterazioni microbiologiche dei mosti e dei vini, grazie all’interazione tra microrganismi utili, in attesa che siano proposti sul mercato ulteriori strumenti per valorizzare appieno questa interessante strategia di lavoro in cantina.
